| Главная О компании Заказ Прайс Публикации Методика Контакты | |
|
Методика
1. Лимфоциты выделяют из гепаринизированной крови центрифугированием на градиенте Фиколл-Верографина (плотность 1,077 г/мл). окрашивания клеток в иммунофлуоресцентном тесте 2. 1-0,1 млн лимфоцитов в объеме 50 мкл вносят в центрифужные пробирки или лунки 96-луночного круглодонного планшета. К клеткам добавляют 5 мкл тестируемого моноклонального антитела и инкубируют 30-45 мин при +4 о С. 3. Добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200 g (1200 об/мин на центрифуге с радиусом 15 см). 4 .Удаляют супернатант. Затем вносят 50 мкл раствора Хенкса, клетки суспендируют, добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200 g. Если в работе используются моноклональные антитела, меченые напрямую флуоресцеин изотиоционатом (FITC) или фикоэритрином (PE), стадия "5" не выполняется. 5. К осадку отмытых клеток добавляют 50 мкл F(ab')2 -фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ и разведенных 1:100. Для разведения используют физраствор, забуференный фосфатами (PBS), содержащий 0,5% желатины и 0,1% азида натрия (вместо PBS можно использовать раствор Хенкса). Клетки суспендируют и инкубируют 30 мин при +4 оС. 6. Клетки 2 раза отмывают как указано в пп. 3-4. 7. Клетки готовы для наблюдения иммунофлуоресценции, однако если результаты теста будут учитываться лишь через несколько часов, то клетки необходимо зафиксировать. Для этого после заключительного центрифугирования и удаления супернатанта к осадку клеток добавляют 50 мкл 1% параформальдегида на PBS (можно использовать раствор формалина разведенный 1:40 на PBS). Клетки суспендируют. Фиксированные клетки сохраняют флуоресценцию в течении недели.
Окрашенные клетки анализируются на проточном цитометре или просматриваются с помощью флуоресцентного микроскопа.
В последнем случае клетки суспендируют, суспензия переносится на предметное стекло, накрывается покровным
стеклом и препарат просматривается под иммерсией на флуоресцентном микроскопе (объектив х 90).
Наилучшее качество изображение достигается при использовании окуляров с небольшим увеличением (х3 или даже х1,7).
Рекомендуется использовать не флуоресцирующее иммерсионное масло. Наблюдение следует проводить в
затемненном помещении. Количество антиген позитивных клеток определяют как % флуоресцирующих клеток при
просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флуоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля.
В качестве отрицательного контроля используют препараты, подготовленные аналогичным образом, за исключением того,
что вместо моноклональных антител клетки обрабатывают раствором Хенкса или нормальным Ig мыши. | |
|